青蒿琥酯抗小鼠血吸虫性肝纤维化的作用

戴方伟(1978-)，女，硕士，副研究员，研究方向：实验动物健康监测及病原诊断方法，共同第一作者，E-mail: ；

褚晓峰(1968-)，男，研究员，研究方向：实验动物与比较医学，通讯作者，Tel：，E-mail: ；

陆绍红(1968-)，女，博士，研究员，研究方向：分子寄生虫病致病机制与防治，通讯作者，Tel：，E-mail:

肝纤维化是肝脏对病毒、寄生虫感染、酒精滥用、代谢性疾病等各种病因所引起的慢性损伤的一种反应，是各种慢性肝病共同的病理学基础，也是肝硬化形成的必经阶段[1]。血吸虫病是一种流行广泛、严重危害人类健康和社会经济发展的人兽共患寄生虫病。血吸虫尾蚴感染宿主后，雌性成虫所产虫卵大部分沉积于肝、肠等组织中，在与机体相互作用的过程中形成虫卵肉芽肿、组织损伤和继发性肝纤维化。肝纤维化是导致血吸虫病患者门脉高压、腹水、上消化道出血等严重并发症与死亡的最根本原因[2]。肝纤维化是一个可逆的病理过程，去除致病因素可以明显减轻肝纤维化，使肝脏功能恢复正常。如果不加以治疗，肝纤维化会转变为肝硬化[3]。对浙江嘉兴市吡喹酮救治的晚期血吸虫病患者随访发现，血吸虫病肝纤维化指标异常者仍然高达75.4%，彻底杀虫治疗并不能中止血吸虫病肝纤维化的进展[4-5]。虽然抗肝纤维化药物相关研究取得了一些进展，但是目前临床尚无理想的抗肝纤维化特效药物。

青蒿琥酯(artesunate，ART)是一种高效抗疟药，也是有效的血吸虫病预防药物。国内研究表明，ART能抑制肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)增殖，具有抗四氯化碳致大鼠肝纤维化以及大鼠免疫性肝纤维化作用[6-8]。壳多糖酶在上皮细胞功能失调、免疫细胞活化、炎症反应与纤维化生成中起重要作用[9]。另外，ART可抑制p-ERK1/2的表达[10]，提示ART抗肝纤维化的作用可能与抑制ERK通路有关。本研究拟以血吸虫性肝纤维化小鼠为动物模型，随机分为ART高、低剂量治疗组、模型组和正常组，以肝组织病理形态观察，结合透明质酸(hyaluronic acid， HA)、基质金属蛋白酶抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1)和Ⅲ型胶原α1(collagen type Ⅲ alpha 1，Col3α1)等分子指标，综合评估治疗前后的肝纤维化进程；通过肝组织中壳多糖酶3样蛋白1(chitinase-3-like protein 1，CHI3L1)、转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)等的表达调控，探讨ART通过CHI3L1/ERK通路，改善血吸虫性肝纤维化的机制。

1材料与方法

1.1 实验动物6周龄ICR清洁级♀小鼠，购自浙江省医学科学院实验动物中心。生产许可证号：SCXK(浙)2014-0001，使用许可证号：SYXK(浙)2014-0008。日本血吸虫感染钉螺，购自江苏省血吸虫病防治研究所。

1.2 药物、试剂与仪器青蒿琥酯粉剂(批号：)，由桂林南药股份有限公司惠赠；吡喹酮(批号：)，上海新华联制药有限公司生产，使用0.04 mol·L-1的羧甲基纤维素钠配制成混悬液备用。HE染色试剂盒(批号：G1120)、Masson染色试剂盒(批号：G1345)，购自上海索莱宝生物科技有限公司；PCR引物，由上海生工生物工程公司合成；TGF-β1抗体(Abcam公司，货号ab)；抗ERK(货号4695)、p-ERK抗体(货号4370)，均购自CST公司；CHI3L1抗体(上海生工，货号D)；β-actin抗体(Servicebio，货号GB)。ADVIO 2400全自动血清生化分析仪(拜耳中国有限公司)；CFX96TM荧光定量PCR仪(伯乐生命医学产品上海有限公司)。

1.3 肝纤维化小鼠模型的建立与实验分组小鼠经腹部剃毛贴片感染日本血吸虫尾蚴，建立动物模型，每只感染(20±2)条尾蚴。24只清洁级小鼠随机分为4组，包括正常组、模型组、ART高、低剂量治疗组(50、25 mg·kg-1·d-1)。各组在感染血吸虫尾蚴7周后，进行连续3 d的吡喹酮灌胃杀虫，剂量为180 mg·kg-1·d-1。根据《日本血吸虫病肝纤维化诊断与疗效评估方案》说明，抗纤维化药物治疗在感染后16周开始，每天灌胃给药，连续8周，停药后4周处死小鼠，取肝脏备用。

1.4 血清肝纤维化指标检测采用全自动血清生化分析仪检测血清HA、Ⅳ型胶原(collagen type Ⅳ，CIV)和血清层黏连蛋白(laminin，LN)。

1.5 肝脏组织病理学观察肝组织经福尔马林溶液固定，石蜡包埋，常规组织切片，进行HE染色和Masson染色观察。根据《日本血吸虫病肝纤维化诊断与疗效评估方案》的规定，结合《肝纤维化诊断及疗效评估共识》，对肝脏的炎症与纤维化程度进行半定量计分。

1.6 肝纤维化与CHI3L1/ERK通路相关基因的qPCR与Western blot检测无菌刀片于干冰上，将组织样品切割成约3 mm×3 mm×3 mm大小，置于装有1 mL TRIzol裂解液的1.5 mL EP管中。将超细匀浆机工作头浸入TRIzol裂解液中5～10 s灭活RNA酶后，组织研磨。参照TRIzol试剂盒步骤抽提RNA，逆转录试剂盒逆转录成cDNA。采用SYBR Green实时荧光定量PCR两步法检测小鼠肝组织内纤维化与ERK信号通路相关基因：平滑肌肌动蛋白α2(alpha-actin-2，ACTA2)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)、TGF-β1、CHI3L1、Col3α1、TIMP-1、ERK1/2(MAPK1、MAPK3)的mRNA表达水平，以GAPDH为内参基因，2-ΔΔCt相对定量法处理数据。引物序列见Tab 1。

文章来源：《中国血吸虫病防治杂志》 网址: http://www.zgxxcbfzzz.cn/qikandaodu/2021/0122/487.html